巨幼细胞性贫血诊断的主要依据是：①消化道症状；②典型的血象改变包括MCV＞95fI，卵圆形大红细胞增多，明显的大小不匀和异形，中性粒细胞分叶过多；③骨髓中出现较多典型的巨幼红细胞等。巨幼细胞性贫血的诊断成立后必须进一步明确是叶酸缺乏还是B12缺乏，根据病史，体征、某些实验室检查及试验治疗的结果加以综合分析.
试验治疗在缺乏特异检查的条件时，可以进行试验治疗，以判断是叶酸缺乏还是B12缺乏。服用叶酸每天0.2mg或B12每天1ug肌注，治疗10天。观察治疗反应，如网织红细胞计数和血红蛋白量增加，巨幼红细胞消失，则为阳性反应，提示为叶酸或B12缺乏。因为生理剂量的叶酸只对叶酸缺乏的病人有效，对B12缺乏的病人则无作用。同样，生理剂量的B12亦只对B12缺乏的病人有作用。
   巨幼细胞性贫血应与红白血症鉴别。红白血病患者的骨髓中亦出现很多巨幼红细胞，但常常还有多少不一的原粒细胞，巨幼红细胞可有多核和特大型，血清叶酸或B12均不减少。用叶酸或B12治疗亦无效。还应与伴有骨髓巨幼样变的其他情况，如白血病、骨髓增生异常综合征、慢性再障、溶血性贫血和遗传性乳清酸尿等鉴别。